高效液相色谱仪操作“三要点”你还不知道？

高效液相色谱仪（HPLC）操作的核心“三要点”为脱气、过滤和冲洗，具体内容如下：

一、脱气

• 目的：消除流动相中的气泡，避免气泡对HPLC系统的影响，如流速降低、系统压力下降、泵停止工作、色谱图出现毛刺、保留时间不重现等。
• 常用脱气方法：

  吹氦脱气法：利用氦气在液体中溶解度低的特性，在0.1MPa压力下，以约60 mL/min流速通入流动相储液容器中10 - 15min，可排除接近80%的氧气，但国内氦气价格较高，实验室较少采用。

  加热回流法：脱气效果较好，操作时要注意冷凝塔的冷却效率，防止溶剂丢失和混合流动相比例变化。

  抽真空脱气法：使用真空泵降压至0.05 - 0.07MPa除去溶解气体，但会使混合溶剂组成发生变化，影响实验重现性，多用于单溶剂体系的简单分析。

  超声波脱气法：将流动相置于超声波清洗器中震荡10 - 20min，脱气效果较差。

  在线脱气法：商品HPLC仪器可配在线脱气机，使用简单、低故障、有效，建议购买仪器时配置。

二、过滤

• 目的：防止颗粒物进入HPLC系统，避免柱子堵塞，延长仪器和色谱柱的使用寿命，提高数据可靠性。颗粒物主要来源于流动相、被测样品和仪器系统部件的磨损物。
• 针对不同来源的过滤措施：

  流动相：

  若流动相均由高效液相色谱级溶剂组成，无需过滤；若缓冲液中加入固体物，如磷酸盐，需用0.45 μm微孔滤膜过滤，0.2 μm微孔滤膜也可用，但过滤速度慢。

  在连接储液瓶和泵的输液管末端入口采用下沉式过滤器（规格为≥10 μm的微孔物质），可除去系统中的尘土，但不能取代流动相过滤步骤。

  被测样品：

  样品放置在自动进样器盘前，先通过0.45 μm针筒式过滤器过滤，但会有样品丢失，包括过滤器滤膜吸附、滤出颗粒物吸附、针筒式滤膜过滤器与针筒连接处渗漏等，需通过实验确认过滤后液体中被测物含量或浓度是否变化。

  在食品残留物分析中，过滤是不可或缺的一步，只要最终检测时信噪比能满足检出限要求，可将过滤导致的丢失视为系统误差而忽略。

  仪器系统部件的磨损物：

  输液泵密封垫：有两种更换建议，一种认为一般实验室中输液泵密封垫使用寿命为六个月到一年，建议半年或一年更换，制定定期预防性维护计划；另一种认为原装密封垫密封效果最好，只要不漏液就不要轻易更换。具体可与仪器公司工程师沟通。一些输液泵有玻璃砂芯或筛网，可滤掉从泵密封垫磨损下来的颗粒物，需查阅操作手册查看推荐的清洗或更换间隔。

  自动进样器旋转轴密封：即使高负荷运转也可使用几年，若有计数进样阀转动次数功能，可设定警铃提醒更换。旋转轴密封磨损后会渗液，表现为同一样品多次进样后峰面积值差别较大（RSD>5%）。

  推荐措施：在HPLC系统中采用一个0.45或0.5 μm的在线多孔过滤器，接在自动进样器和柱子之间，即使已使用保护柱。当压力上升一定值（如25%或增加500psi），应更换玻璃砂芯滤板，更换后冲洗几分钟系统可恢复到原来的压力值。

三、冲洗

• 目的：保持系统清洁，使系统处于“ready”状态。
• 针对不同部位的冲洗措施：

  流动相储液瓶：

  经常清洗，或每做一批新样品更换一次流动相。缓冲液使用时间不要超过一周，有机溶剂使用时间不要超过一个月。

  仪器公司工程师建议储水瓶的水天天换，每周用异丙醇清洗一次瓶子，也可在水里加入0.1 - 1 mM的甲酸抑制微生物生长。

  泵：分析完后，若流动相中含有难挥发的缓冲液（如磷酸盐），停泵前一定要用非缓冲液流动相冲洗泵半个小时以上，若流动相中有难挥发缓冲盐，建议冲洗时间更长。

  自动进样器：按规定清洗，注意及时更换、补充冲洗液。自动进样器用的洗涤液也要根据溶剂有效期和规定，清洗储液瓶或更换洗涤液。时间允许时，每次分析完后设置进1、2针纯溶剂（如甲醇、乙腈）。

  色谱柱：每一批样品分析结束后或准备卸下柱子时，用大量的流动相冲洗柱子（如甲醇、乙腈和水），梯度冲洗效果更好，具体比例根据柱子说明书和性质而定。

  检测器：

  UV/VIS检测器或FL检测器，在对柱子和系统进行冲洗时一同对检测器流通池中污染物进行清洗。

  蒸发光检测器或质谱仪需要按照说明书进行定期清洗，联有这些检测器的系统冲洗时，最好与检测器断开，以减少污染。

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